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动物脾脏组织中性粒细胞分离液 KIT 说明书

2016-07-28      948

动物脾脏组织中性粒细胞分离液 KIT 说明书

 

【产品规格】

 

200ml/Kit

 

【产品组成】

 

为方便广大用户使用,试剂内容如下:

 

 

 

 

名称

产品编号

 

规格

 

 

A

试剂 A

 

 

 

 

 

200ml

 

 

B

试剂 F(赠品)

 

 

F2013TBD

 

200ml

 

 

C

样本稀释液(赠品)

2010C1119

 

200ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

D

清洗液(赠品)

 

 

2010X1118

 

200ml

 

 

E

红细胞裂解液(赠品)

NH4CL2009

 

100ml

 

 

F

说明书

 

 

 

 

 

1 份

 

【实验前准备】

 

 

 

 

 

 

 

A. 适用仪器

 

 

 

 

 

 

 

 

zui大离心力可达 1200g 的水平转子离心机

 

 

 

 

 

B. 耗材

 

 

 

 

 

 

 

 

 

产品名称

 

产品货号

 

产地

 

 

 

15ml 离心管散装

 

339650

 

美国 NUNC

 

 

 

15ml 离心管架装

 

339651

 

美国 NUNC

 

 

 

50ml 离心管散装

 

339652

 

美国 NUNC

 

 

 

50ml 离心管架装

 

339653

 

美国 NUNC

 

 

无菌胶头滴管或塑料滴管

【检验方法】

1.全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。

2.首先制备脾脏组织单细胞悬液,制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。

取一支 15ml 离心管,小心加入 5ml 试剂 A。

3.用吸管小心吸取细胞悬液样本加于分离液之液面上,400-550g ,离心 20-30min(注:如改变样本及分离液用量,需相应调整离心力及离心时间,具体离心条件需客户自行摸索,以达到zui佳分离效果)。

4.离心后,离心管中将出现两层环状乳白色细胞层,上层细胞为单个核细胞层,下层细胞为中性粒细胞层。

5.用吸管小心吸取分离液中的中性粒细胞层,如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液(产品编号:NH4CL2009)将红细胞裂解(具体方法见“红细胞裂解液使用说明”)即得目的细胞。

6.将获得的细胞层移至另一 15ml 离心管中,向所得离心管中加入 10ml 清洗液(产品编号:2010X1118),混匀细胞。

7.250g,离心 10min。

8.弃上清。

9.用吸管以 5ml 清洗液(产品编号:2010X1118)重悬所得细胞。

10.250g,离心 10min。

11.重复 8、9、10,弃上清后以 0.5ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

 

【注意事项】

1.全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得zui佳的实验结果,需在取样 2h 内进行实验。

2.本实验zui好不使用高聚合材质(如聚苯乙烯)的塑料制品,应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品,因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面,影响细胞分离效果。

3.分离液用量大于脾脏组织单细胞悬液样本量时,分离效果更佳。

4.如实验后细胞得率或活性过低,请天津灏洋以寻求帮助,具体详见下方生产企业信息。

【储存条件及有效期】

18-25℃保存,有效期 2 年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启

封后置常温保存。如 4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。

【参考值(参考范围)】

本实验中性粒细胞提取率大于 80%。

下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例,用户可适当进行参考。

 

 

红细胞

 

白细胞

血小板

含量(个/L)

(4.0-5.5)×1012

(4.0-10.0)×109

(1.0-3.0)×1011

中性粒细胞

淋巴细胞

单核细胞

 

 

 

                                  50%-70%    20%-40%    3%-8%

【相关实验技术方案】

1.脾脏组织单细胞悬液制备技术。

2.所获得中性粒细胞的培养技术。

3.所获得中性粒细胞的核酸提取技术。

4.所获得中性粒细胞的鉴定方法A.流式细胞技术B.免疫组化技术C.原位杂交技术D.PCR 技术

【可能存在的问题及解决方法】

1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示:

 

出现情况

出现原因

建议解决方案

离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层

转速过小或离心时间过短

适当增减转速

离心后目的细胞存在于分离液中

转速过大或离心时间过长

 

离心后白环层弥散

细胞密度过大

调整细胞密度

离心后白环层太浅或看不见

细胞密度过小

 

2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心,其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时,恒定离心时间,对离心转速进行调整。

3.本分离液依照国际标准,全部使用药用级原料,性能指标与国产同类产品略有不同,可能出现红细胞沉降不完全的情况,可以适当加大离心转速。

注:在对离心条件进行调整时,离心转速的加减以 50-100g 为基数,直至达到zui佳分离效果,

离心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。