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动物外周血白细胞分离液实验方法

2016-07-28      1345

 

“XXXX”动物外周血白细胞分离液实验方法

 

(细胞培养及分子生物学专用)

 

【产品规格】

 

200ml/Kit

 

【产品组成】

 

为方便广大用户使用,试剂内容如下:

 

 

 

 

名称

产品编号

 

规格

 

 

A

XXXX 动物外周血白细胞分离液

 

 

 

200ml

 

 

B

样本稀释液(赠品)

2010C1119

 

200ml

 

 

C

清洗液(赠品)

 

 

2010X1118

 

200ml

 

 

D

红细胞裂解液(赠品)

NH4CL2009

 

100ml

 

 

E

说明书

 

 

 

 

 

1 份

 

【实验前准备】

 

 

 

 

 

 

 

A. 适用仪器

 

 

 

 

 

 

 

 

zui大离心力可达 1200g 的水平转子离心机

 

 

 

 

 

B. 耗材

 

 

 

 

 

 

 

 

 

产品名称

 

产品货号

 

产地

 

 

 

15ml 离心管散装

 

339650

 

美国 NUNC

 

 

 

15ml 离心管架装

 

339651

 

美国 NUNC

 

 

 

50ml 离心管散装

 

339652

 

美国 NUNC

 

 

 

50ml 离心管架装

 

339653

 

美国 NUNC

 

 

无菌胶头滴管或塑料滴管

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。

首先取抗凝血,根据样本量大小,分以下两种情况:

情况 A:血液样本量小于 5ml 时,实验方法如下:

1.取一支 15ml 离心管,先加入 5ml 分离液

2.用吸管小心吸取血液样本加于分离液液面上,400-500g,离心 20-30min(注:如改变血液样本及分离液用量,需相应调整离心力及离心时间,具体离心条件需客户自行摸索,以达到zui佳分离效果。)

3.离心后用吸管小心吸取所有环状乳白色细胞层(一层或两层),加入 10 ml 清洗液(产品编号:2010X1118),混匀细胞。250g,离心 10min。重复洗涤 2-3 次,即得所需白细胞。

4.如有红细胞残留请使用红细胞裂解液(产品编号:NH4CL2009)裂解红细胞,具体操作方法详见“红细胞裂解液使用说明”。

情况 B:血液样本量大于等于 5ml 时,实验方法如下:

1.取一支适当的离心管,先加入与样本等量的分离液。

2.将血液样本小心加于分离液之液面上,450-650g(zui大离心力可至 1000g),离心20-30min。(注:根据血液样本量确定离心条件,血液量越多,离心力越大,离心时间越长,具体离心条件需客户自行摸索,以达到zui佳分离效果。加入血液样本后,样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二)。

3.剩余步骤同“情况 A”中步骤 3 与步骤 4。

 

【注意事项】

1.全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得zui佳的实验结果,zui好在取血 2h 内进行实验,血液存放时间越长,细胞分离效果越差。血液放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2.本实验zui好不要使用高聚合材质(如聚苯乙烯)的塑料制品,应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品,因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面,影响细胞分离效果。

3.分离液用量大于稀释后血液样本时,分离效果更佳。

4.当血液样本粘度过高需稀释时,zui优稀释方法:将血液与样本稀释液(产品编号:2010C1119)1:1 稀释混匀备用。注:不当的稀释方法会降低细胞得率及活性。如血液样本经过稀释则分离过程中需适当降低离心力和离心时间。

5.如实验后细胞得率或活性过低,请天津灏洋以寻求帮助,具体详见下方生产企业信息。

【储存条件及有效期】

18-25℃保存,有效期 2 年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启封后置常温保存。如 4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。

【参考值(参考范围)】

本实验白细胞提取率及纯度大于 80%。

下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例,用户可适当进行参考。

 

 

红细胞

 

白细胞

 

血小板

 

 

(4.0-10.0)×109

 

含量(个/L)

(4.0-5.5)×1012

中性粒细胞

淋巴细胞

单核细胞

(1.0-3.0)×1011

 

 

50%-70%

20%-40%

3%-8%

 

【相关实验技术方案】

1.所获得白细胞的培养技术。

2.所获得白细胞的核酸提取技术。

3.所获得白细胞的鉴定方法A.流式细胞技术B.免疫组化技术C.原位杂交技术D.PCR 技术

【可能存在的问题及解决方法】

 

1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示:

 

出现情况

出现原因

建议解决方案

离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层

转速过小或离心时间过短

适当增减转速

离心后目的细胞存在于分离液中

转速过大或离心时间过长

 

离心后白环层弥散

细胞密度过大

调整细胞密度

离心后白环层太浅或看不见

细胞密度过小

 

2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心,其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时,恒定离心时间,对离心转速进行调整。

3.本分离液依照国际标准,全部使用药用级原料,性能指标与国产同类产品略有不同,可能出现红细胞沉降不完全的情况,可以适当加大离心转速。

注:在对离心条件进行调整时,离心转速的加减以 50-100g 为基数,直至达到zui佳分离效果,

 

离心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。