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人外周血淋巴细胞分离液推动了实验发展

2016-04-08      点击:730

    人外周血淋巴细胞分离液推动了实验发展

    人外周血淋巴细胞分离液包括淋巴细胞和单核细胞等细胞,其体积、形态和密度与其他细胞不同,红细胞和白细胞等细胞密度较大,为1.090 g/ml左右,而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/ml,血小板为1.030~1.035 g/ml。为此,将葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合,调整比重、pH值和渗透压,经过澄清及除菌过滤后制成一种密度在1.077g/ml并且近于等渗的人外周血淋巴细胞分离液,经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。

    人外周血淋巴细胞分离液为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液。主要成分是Ficoll 400与泛影酸葡甲胺。人外周血淋巴细胞分离液适用于从血液分离所需细胞,在医疗和医学生物学研究中广泛应用。其他人及动物多种比重细胞分离液。注:因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同,所以用户在定制分离液时应提供所需分离液的比重、动物的种属及被分离细胞的名称。将采到的肝素抗凝血取样计数白细胞总数。使用人外周血淋巴细胞分离液将血样1:1稀释,混匀时要沿管壁吹出,避免产生气泡。吹匀后于37℃水浴中平衡。从冰箱中取出4℃避光保存的人外周血淋巴细胞分离液。摇匀后在无菌状态下加入刻度离心管中。操作中尽量避免吸管碰触管壁。原则上分离液的高度不超过管高的1/4。

    将盛有分离液的离心管放入37℃水浴中平衡,用吸管将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离液面上,用力要轻,避免血液冲入分离液中,使得稀释血重叠在分离液面以上,拧紧管盖。稀释血与分离液的高度比在1:2-2:1之间。原则上两者的总高度不超过离心管的2/3。将离心管放置于水平离心机中,室温下 2000rpm离心20min。离心过程中要观察离心速度是否正确,且在停止时选择“no break”,避免因为急剧减速将已经分离的单个核细胞层重新弄混。注意离心结束时的减速过程,不要太快。人外周血淋巴细胞分离液离心结束后可见管内分为四层,从上至下分别为:血浆层(含部分血小板)、白膜层(含单个核细胞及少量血小板)、分离液层、粒细胞及红细胞层。将吸管轻轻穿过血浆层至白膜层,沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞,置于新离心管中。尽量少吸取分离液。

    人外周血淋巴细胞分离液注意吹打均匀,不要有细胞团块。室温下1500rpm离心5min,洗涤两次。zui后一次洗涤时定量加入RPMI1640,吹打均匀后取样计数细胞,zui后一次离心完毕倾倒出上清液后请请要度离心管,将管底细胞摇匀。根据上一步的计数结果,用含FBS10%-20%、双抗的RPMI1640培养液将细胞配成所需浓度。人外周血淋巴细胞分离液的离心管以小管径为佳,细胞层相对厚,便于淋巴细胞的吸取,2000rpm的相对离心力大概在573g-708g,不同的离心机可以注意计算一下离心力与转数的关系。人外周血淋巴细胞分离液离心速度太慢或时间不足时,淋巴细胞层较薄,且在这个层面上有红细胞混杂;离心速度太快或时间过长时,淋巴细胞层相对分散,会进入下面的分离液层,每次将离心管带入超净台内时要用酒精擦拭离心管,尤其管口和管帽。