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人外周血淋巴细胞分离液步骤

2016-11-14      点击:964
  人外周血淋巴细胞分离液步骤,将采到的肝素抗凝血取样计数白细胞总数.使用Hank’s液/PBS液/无血清RPMI1640将血样1:1稀释,混匀时要沿管壁吹出,避免产生气泡。吹匀后于37℃水浴中平衡.从冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分离液。摇匀后在无菌状态下加入刻度离心管中。操作中尽量避免吸管碰触管壁。原则上分离液的高度不超过管高的1/4.将盛有分离液的离心管放入37℃水浴中平衡.用吸管将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离液面上,用力要轻,避免血液冲入分离液中,使得稀释血重叠在分离液面以上,拧紧管盖。稀释血与分离液的高度比在1:2-2:1之间。原则上两者的总高度不超过离心管的2/3。
  人外周血淋巴细胞分离液将离心管放置于水平离心机中,室温下 2000rpm离心20min。离心过程中要观察离心速度是否正确,且在停止时选择“no break”,避免因为急剧减速将已经分离的单个核细胞层重新弄混。注意离心结束时的减速过程,不要太快.离心结束后可见管内分为四层,从上至下分别为:血浆层(含部分血小板)、白膜层(含单个核细胞及少量血小板)、分离液层、粒细胞及红细胞层。将吸管轻轻穿过血浆层至白膜层,沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞,置于新离心管中。尽量少吸取分离液。
  人外周血淋巴细胞分离液zui后一次离心完毕倾倒出上清液后请要度离心管,将管底细胞摇匀。根据上一步的计数结果,用含FBS10%-20%、双抗的RPMI1640培养液将细胞配成所需浓度.核心技术,如实陈述.