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各种动物脏器组织单核细胞分离液实验方法说明书

2016-12-06      点击:1075

各种动物脏器组织单核细胞分离液实验方法说明书

【产品规格】

2×200ml/Kit

【产品组成】方便广大用户使用,试剂内容如下:

 

 

 

 

名称

产品编号

 

规格

 

 

A

试剂A

 

 

 

 

 

200ml

 

 

B

试剂D

 

 

 

 

 

200ml

 

 

C

样本稀释液(赠品)

2010C1119

 

200ml

 

 

D

清洗液(赠品)

 

 

2010X1118

 

200ml

 

 

E

F 液(赠品)

 

 

F2013TBD

 

200ml

 

 

说明书

 

 

 

 

 

1

 

【实验前准备】

 

 

 

 

 

 

 

A 适用仪器

 

 

 

 

 

 

 

 

zui大离心力可达 1200g 的水平转子离心机

 

 

 

 

 

B 耗材

 

 

 

 

 

 

 

 

 

产品名称

 

产品货号

 

产地

 

 

 

15ml 离心管散装

 

339650

 

美国 NUNC

 

 

 

15ml 离心管架装

 

339651

 

美国 NUNC

 

 

 

50ml 离心管散装

 

339652

 

美国 NUNC

 

 

 

50ml 离心管架装

 

339653

 

美国 NUNC

 

 

 

无菌胶头滴管或塑料滴管

 

 

 

 

 

 

 

【检验方法】

 

 

 

 

 

 

 

 

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。

 

1首先制备脏器组织单细胞悬液,制备方法详见组织单细胞悬液制备技术

 

2取一支 15ml 的离心管,依次小心加入试剂 A、试剂 D(体积比为 3:2,试剂总量与样本量相等。如脏器组织单细胞悬液为 5ml,则先后加入试剂 A 3ml、试剂 D 2ml),制成梯度界面,各液面分层一定要清晰。

3用吸管小心吸取脏器单细胞悬液样本加于分离液液面上,400-550g,离心 20-30min(注:根据脏器单细胞悬液量确定离心条件,样本量越多,离心力越大,离心时间越长,具体离心条件需客户自行摸索,以达到zui佳分离效果)。

4离心后,此时离心管中由上至下分为五层。*层为稀释液层。第二层为透明试剂 D 液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂 A 液层。第五层为红细胞层。

5 用吸管小心吸取第二层试剂 D 层和第三层乳白色细胞层到另一 15ml 离心管中,往所得离心管中加入 10ml 清洗液(产品编号:2010X1118),混匀细胞。

6 250g,离心 10min

7弃上清。

8用吸管以 5-10ml 清洗液(产品编号:2010X1118)重悬所得细胞。

9 250g,离心 10min

10重复 789,弃上清后以 0.5ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

11 差异贴壁法纯化细胞

1)用单核细胞无血清培养基(产品编号:CTBD2011)或单核细胞完全培养基(产品

编号:HCTBD2011)以 1.5-3×106 /ml 的密度重悬细胞,将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中,放于 37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。

22-4 小时内贴壁的为巨噬细胞前体(俗称为单核细胞)。

 

310-24 小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。(4)不贴壁的为淋巴细胞。

 

注:

 

a)无血清培养基中不含任何动物成分,为得到更佳培养效果可添加 10%自体血浆或2-8%经灏洋筛选的胎牛血清。

 

b)完全培养基中含 2-20%胎牛血清(血清具体含量由所培养的目的细胞而定)。

 

c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的,此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴

 

性分选。

 

【注意事项】

 

1 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得zui佳的实验结果,zui好在取样 2h 内进行实验,样本存放时间越长,细胞分离效果越差。样本放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2 本实验zui好不使用高聚合材质(如聚苯乙烯)的塑料制品,应使用无静电、低静电离心

管及未经碱处理过后的玻璃制品,因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会

变成毛面,影响细胞分离效果。

3 吸取过多的单核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。

4 分离液用量大于脏器组织单细胞悬液样本量时,分离效果更佳。

5 如实验后细胞得率或活性过低,请天津灏洋以寻求帮助,具体详见下方生产企业信息。

【储存条件及有效期】

18-25℃保存,有效期 2 年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启封后置常温保存。如 4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。

【参考值(参考范围)】

本实验单核细胞提取率大于 80%

下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例,用户可适当进行参考。

 

 

红细胞

 

白细胞

 

血小板

 

 

4.0-10.0×109

 

含量(个/L

4.0-5.5×1012

中性粒细胞

淋巴细胞

单核细胞

1.0-3.0×1011

 

 

50%-70%

20%-40%

3%-8%

 

 

【相关实验技术方案】

 

1 脏器组织单细胞悬液制备技术。

 

2 所获得单核细胞的培养技术。

 

3 所获得单核细胞的核酸提取技术。

 

4 所获得单核细胞的鉴定方法

A.流式细胞技术

B.免疫组化技术

C.原位杂交技术

D.PCR 技术

 

【可能存在的问题及解决方法】

 

1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示:

 

 

 

出现情况

出现原因

建议解决方案

 

 

离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层

转速过小或离心时间过短

适当增减转速

 

 

离心后目的细胞存在于分离液中

转速过大或离心时间过长

 

 

 

 

 

离心后白环层弥散

细胞密度过大

调整细胞密度

 

 

离心后白环层太浅或看不见

细胞密度过小

 

 

 

 

2 本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心,其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时,恒定离心时间,对离心转速进行调整。

3 本分离液依照国际标准,全部使用药用级原料,性能指标与国产同类产品略有不同,可能出现红细胞沉降不完全的情况,可以适当加大离心转速。

注:在对离心条件进行调整时,离心转速的加减以 50-100g 为基数,直至达到zui佳分离效果,

离心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。